Nukleiinhapete sünteesi põhimõtted

Nukleiinhapete süntees viiakse läbi tahke faasi siaalamiidi triglütseriidi meetodil, mille käigus DNA 3' ots immobiliseeritakse tahke faasi substraadile ja nukleotiide lisatakse 3' kuni 5' suunas, kuni soovitud DNA fragment on sünteesitud. .See erineb DNA sünteesist DNA polümeraasi rakendamise poolest.

Esimese aluse 3'-ots immobiliseeritakse sünteesi käigus CPG-le, järgmise aluse 5'-OH kaitstakse di-p-tolüültritüül-DMT-ga, aluse aminorühm on kaitstud bensoehappega ja 3'-ots. Seejärel aktiveeritakse -OH aminofosfaatühendiga.1 alus 5 5'-OH 1 alusest ja 3'-OH järgmisest alusest moodustavad fosfittriglütseriidi, mis seejärel oksüdeeritakse joodiga fosfaattriglütseriidiks, teisel alusel 5'-OH kaitseaine eemaldatakse dikloroäädikhappe lisamine DM tsüklid läbi järgmise aluse lisamise ja pärast sünteesi eemaldatakse 5'-OH kaitseaine nõrga happega. Fragment ühendatakse tahke vaigu küljest lahti kontsentreeritud ammooniumhüdroksiidiga, kaitseaine eemaldatakse aluselt kontsentreeritud ammooniumhüdroksiidiga kuumutamisel eemaldatakse ammooniumhüdroksiid, fragment kuivatatakse vaakumis ja nukleiinhape puhastatakse vedelikkromatograafia või PAGE abil.

Oligosünteesi etapid

Deblokeerimine

The5-otsaline DMT kaitserühm eemaldatakse TCA lahuse lisamisega.

Aktiveerimine

Aktivaatori segamine oligonukleotiidmonomeeriga, et moodustada aktiivne oligonukleotiidmonomeeri vaheühend.

Sidumine

5-otsa hüdroksüülrühm reageerib aktiivse oligonukleotiidi vaheühendiga antigeneratiivses kondensatsioonireaktsioonis, moodustades ebastabiilse fosfittriglütseriidsideme.

Korgistamine 

Katteaine lisamine viib läbi atsetüülimise katmisreaktsiooni liigsete hüdroksüülrühmadega, mis ei osale kondensatsioonireaktsioonis.

Oksüdatsioon 

Vett sisaldava joodilahuse lisamine reageerib oksüdatsiooni teel ebastabiilsete fosfitsidemetega, moodustades stabiilsed fosforhappe triglütseriidsidemed.

Tsüanoetüül lõhustamine

Nukleiinhappe produkt pärast sünteesi, millele on lisatud DEA lahust, et eemaldada tsüanoetüülrühm fosfaattriglütseriidsidemest.

Lõhustatud ja kaitse eemaldamine

Nukleiinhappefragmendid eraldatakse tahke faasi kandja küljest kontsentreeritud ammooniumhüdroksiidi lahuse lisamisega ja seejärel kuumutatakse, et eemaldada kaitserühmad aluste vesiniksidemetest.